1. 高效液相色譜儀（HPLC）簡介

• 定義與原理

• 高效液相色譜儀（High-Performance Liquid Chromatography，簡稱HPLC）是一種廣泛應用于化學分析中的分離技術。其基本原理是基于不同化合物在兩相（固定相和流動相）間分配行為的差異，從而實現分離、鑒定和定量分析。

• 固定相通常為顆粒狀填充物，裝填在色譜柱內，而流動相則是以液體形式存在，通常是混合溶劑，依靠泵的作用通過色譜柱。

• 通過調節流動相的組成、流速和柱溫，可以實現對復雜混合物中各組分的有效分離。

• 應用領域

• HPLC廣泛應用于藥物分析、食品安全檢測、環境監測、生物化學研究等領域。例如，在藥物分析中，它常用于純度檢測、含量測定、雜質分析等。

2. 高效液相色譜儀的組成部分

• 泵系統

• 泵的作用是將流動相以恒定的流速輸送到色譜柱中。常見的泵類型包括等度泵和梯度泵。等度泵輸送的流動相組成恒定，而梯度泵則能夠在分析過程中改變流動相的組成。

• 進樣器

• 進樣器用于將樣品引入流動相。常見的進樣方式包括手動進樣和自動進樣。自動進樣器可以提高實驗的重復性和精確度，尤其在高通量樣品分析中尤為重要。

• 色譜柱

• 色譜柱是HPLC的核心部件，通常填充有固定相材料。不同的色譜柱可以實現不同的分離效果。常見的色譜柱類型包括反相柱、正相柱和離子交換柱等。

• 檢測器

• 檢測器用于檢測分離后的各組分。常見的檢測器類型有紫外檢測器（UV）、熒光檢測器（FLD）、蒸發光散射檢測器（ELSD）和質譜檢測器（MS）等。不同的檢測器具有不同的靈敏度和適用范圍。

• 數據處理系統

• 數據處理系統用于記錄并分析檢測器的信號輸出，常見的數據分析包括峰面積積分、定量分析、峰形解析等。

3. 高效液相色譜儀的操作步驟

• 1. 開機準備

• 檢查HPLC系統各部分的連接是否緊密，特別是泵、色譜柱和檢測器的連接。

• 啟動HPLC軟件系統，檢查是否正常啟動，確認流動相溶劑已正確準備并脫氣。

• 設置泵的流速、柱溫和梯度程序（如適用），確保各參數符合實驗要求。

• 2. 流動相的準備與脫氣

• 準備流動相溶劑，通常根據實驗需要配制不同比例的混合溶劑，如水-甲醇、水-乙腈等。

• 脫氣是為了去除流動相中的溶解氣體，以避免在分離過程中產生氣泡，影響分析結果。常見的脫氣方法包括超聲波脫氣和在線脫氣。

• 3. 進樣操作

• 根據樣品性質選擇合適的進樣量，一般在微升至毫升級之間。

• 手動進樣時，使用進樣針注入樣品至進樣閥中，確保無氣泡。

• 自動進樣器則需預先設置好進樣參數，并檢查樣品瓶是否安裝正確。

• 4. 分離與檢測

• 樣品進入色譜柱后，開始分離過程。不同組分根據其在固定相和流動相中的分配系數不同，依次從色譜柱中洗脫出來。

• 檢測器檢測到各組分后，輸出信號至數據處理系統，形成色譜圖。

• 5. 數據處理

• 通過軟件對色譜圖進行分析，識別各個峰，并通過峰面積或峰高進行定量。

• 比較樣品中各組分的保留時間與標準物質，確定其成分。

• 6. 實驗結束與關機

• 實驗結束后，使用純流動相沖洗色譜柱和系統，以防止樣品殘留導致色譜柱污染。

• 逐步降低泵的流速至零，關閉系統電源，妥善保存色譜柱。

4. HPLC的維護與保養

• 定期清洗色譜柱

• 色譜柱是HPLC系統中最昂貴且易損的部件之一。為了延長色譜柱的使用壽命，需定期用適當的溶劑沖洗柱子，避免樣品和流動相中的雜質殘留。

• 流動相的管理

• 流動相必須新鮮制備，并進行充分脫氣。儲存時間過長的流動相容易產生細菌或沉淀，影響分析結果。

• 進樣器的維護

• 定期清洗進樣器和樣品環，防止樣品殘留導致的交叉污染。

• 泵系統的保養

• 定期更換泵的密封墊圈和其他易損件，以保證泵的穩定運行。

• 檢測器的校準

• 檢測器靈敏度的變化可能導致定量誤差，因此需要定期校準檢測器，確保其靈敏度在規定范圍內。

5. 常見問題及解決方法

• 基線漂移

• 基線漂移常見原因包括流動相配制不當、流動相脫氣不充分、柱溫不穩定等。解決方法是重新配制和脫氣流動相，檢查柱溫控制裝置。

• 樣品峰分裂

• 樣品峰分裂可能是進樣量過大、樣品溶解度不足、流動相極性不匹配等導致的。可以嘗試減少進樣量、調整樣品溶劑或優化流動相配比。

• 柱壓過高

• 柱壓過高可能是色譜柱堵塞或流動相粘度過大導致的。可以更換色譜柱前端的保護柱，或使用低粘度的流動相。

• 樣品重復性差

• 樣品重復性差可能是由于進樣器污染、柱子老化或泵系統不穩定導致的。解決方法包括清洗進樣器、使用新色譜柱、檢查泵的運行狀態。

6. 高效液相色譜法中的流動相選擇

在高效液相色譜（HPLC）操作中，流動相的選擇至關重要。流動相的性質不僅會影響分離效果，還會影響色譜柱的壽命、檢測器的靈敏度以及整個系統的穩定性。流動相的選擇通常基于以下幾個因素：

• 溶劑極性

• 流動相的極性對分離過程有重要影響。對于反相色譜，一般選用極性較低的有機溶劑（如甲醇、乙腈）與水混合。對于正相色譜，則多選用極性較高的有機溶劑（如正己烷、乙酸乙酯）。

• 實驗中，通過改變流動相的極性，可以調節各組分的保留時間，實現理想的分離效果。

• pH值

• 流動相的pH值對樣品中酸性或堿性化合物的離子化程度有顯著影響，進而影響其保留行為。

• 在反相色譜中，通常通過加入磷酸鹽緩沖液來調節pH，以保持樣品的穩定性和提高分離度。

• 溶劑的粘度與沸點

• 流動相的粘度直接影響系統的柱壓和泵的負荷。較高粘度的溶劑可能會導致柱壓升高，需謹慎使用。

• 沸點低的溶劑容易在系統中產生氣泡，影響分離效果。因此，需根據實際情況選擇適當沸點的溶劑。

• 紫外吸收性質

• 如果使用UV檢測器，流動相溶劑的吸光度需盡量低，以避免干擾樣品檢測。例如，甲醇和乙腈在較低波長范圍內具有較低的背景吸收，是常見的流動相選擇。

7. 色譜柱的選擇與維護

高效液相色譜中的色譜柱是決定分離效果的關鍵組件。選擇合適的色譜柱能夠有效提高分離效率和分析精度。

• 色譜柱的類型

• 反相色譜柱：最為常見，使用非極性或弱極性固定相，如C18柱（十八烷基鍵合硅膠柱）。適用于大多數有機化合物的分離。

• 正相色譜柱：使用極性固定相，如硅膠柱，適用于極性化合物的分離。

• 離子交換柱：適用于帶電分子的分離，固定相帶有離子交換基團，如陽離子交換柱和陰離子交換柱。

• 體積排阻色譜柱：適用于分子量差異較大的化合物分離，常用于生物大分子的分析。

• 色譜柱的維護

• 預柱使用：在色譜柱前端安裝預柱（保護柱），可有效延長主柱的使用壽命，避免樣品中的顆粒物或強吸附性物質污染主柱。

• 定期沖洗：使用適當的溶劑沖洗色譜柱，防止樣品或流動相中的雜質在柱中積聚。常用沖洗溶劑為甲醇、水或異丙醇。

• 儲存注意事項：在不使用時，將色譜柱儲存在適宜的溶劑中（如乙腈），避免干燥和污染。

8. HPLC數據處理與分析

在HPLC操作中，數據處理是一個關鍵環節。色譜圖的解析、定量分析的準確性、峰面積的積分等都依賴于有效的數據處理。

• 色譜圖解析

• 色譜圖中的每個峰代表樣品中一個成分的分離結果。通過保留時間（Retention Time, RT），可以初步判斷樣品中各成分的種類。

• 對于復雜樣品，可能會出現峰重疊的情況，此時需要通過改變流動相組成、流速或使用更長的色譜柱來優化分離。

• 定量分析

• 定量分析通常通過外標法、內標法或標準曲線法來實現。外標法常用于簡單樣品的分析，而內標法適用于復雜基質樣品，以提高定量精度。

• 標準曲線法需要制備一系列已知濃度的標準溶液，測定其峰面積或峰高，并繪制濃度-響應曲線。樣品濃度可以通過與標準曲線的對比來確定。

• 峰面積積分

• 峰面積的準確積分是定量分析的基礎。現代HPLC軟件通常具備自動積分功能，但在遇到基線漂移、峰形不對稱或干擾峰時，需手動調整積分參數。

• 注意積分時應選擇適當的基線，避免錯誤積分導致的定量誤差。

9. HPLC的質量控制與驗證

為了確保HPLC分析結果的可靠性，進行嚴格的質量控制與方法驗證是必要的。

• 方法驗證

• 在開始正式分析之前，需要對所用的HPLC方法進行驗證，包括線性、準確度、精密度、檢測限和定量限等參數。

• 線性：驗證樣品濃度與峰面積或峰高的線性關系，確保在分析范圍內結果的可預測性。

• 準確度：通過回收率實驗，驗證分析方法的準確性。通常將已知濃度的標準物加入基質樣品中，檢測其回收率。

• 精密度：通過重復進樣和分析，驗證方法的重現性。通常用相對標準偏差（RSD）來衡量精密度。

• 檢測限（LOD）和定量限（LOQ）：分別表示能夠檢測和定量的最低樣品濃度。

• 儀器校準

• 定期對HPLC儀器進行校準，包括泵流量校準、進樣器校準和檢測器靈敏度校準等。校準可以通過使用已知濃度的標準溶液或專用校準工具來進行。

10. HPLC常見故障及排除方法

在HPLC操作過程中，可能會遇到一些常見故障，影響實驗的順利進行。下面列出幾種常見故障及其解決方法：

• 基線噪音過大

• 可能原因包括檢測器燈源老化、流動相不純或色譜柱污染。可以通過更換燈源、使用高純度流動相或清洗色譜柱來解決。

• 色譜柱堵塞

• 色譜柱堵塞通常由于樣品雜質或流動相不純導致。可以嘗試使用反向沖洗色譜柱、增加預柱或更換色譜柱來解決問題。

• 保留時間漂移

• 保留時間漂移可能是由于流動相組成變化、柱溫不穩定或泵流量不穩定導致。應檢查流動相配比、確認柱溫和泵流量的穩定性。

• 檢測器響應異常

• 如果檢測器的響應異常，可能是由于燈源問題、流動相中有氣泡或檢測器未正確校準。可以通過更換燈源、在線脫氣和重新校準檢測器來解決。

11. HPLC的安全操作注意事項

HPLC操作涉及使用有機溶劑和高壓設備，因此需要嚴格遵守實驗室安全規定，以確保操作人員的安全。

• 溶劑處理

• 使用溶劑時，需佩戴防護手套和防護眼鏡，避免直接接觸。揮發性溶劑應在通風櫥中操作，避免吸入有害氣體。

• 廢液處理應遵循實驗室規定，分類收集，并通過專門的廢液處理系統進行處理。

• 高壓系統

• HPLC系統的泵和色譜柱處于高壓狀態，操作時需確保所有接頭緊密，防止泄漏。定期檢查管路和接頭的密封性，避免因高壓泄漏導致的危險。

• 電氣安全

• HPLC儀器為電氣設備，需定期檢查電源線、插頭及接地線，避免因電氣故障導致的安全隱患。

• 緊急措施

• 在操作過程中，如遇到溶劑泄漏、設備故障等緊急情況，應立即停止操作，關閉電源，并按實驗室緊急預案進行處理。